1. Головна
    2. Біологія
    3. Як провести фарбування за Грамом (з ілюстраціями)

Як провести фарбування за Грамом (з ілюстраціями)

Фарбування по Граму - це експресний метод дослідження, що дозволяє встановити наявність бактерій в зразку і диференціювати їх як грампозитивні або грамнегативні. Метод заснований на хімічних і фізичних властивостях клітинної оболонки.[1] Метод Грама майже завжди застосовують в якості першого кроку при діагностицібактеріальних інфекцій .

Метод був запропонований датським вченимГ. К. Грамом, який розробив його в 1882 і опублікував в 1884 році, як спосіб, що дозволяє диференціювати подібні за симптомами бактеріальні інфекції: Streptococcus pneumoniae (пневмокок) і Klebsiella pneumoniae.[2]

Частина1З 3:
Підготовка зразка

  1. Приготуйтеся до роботи.одягніть рукавички і підв'яжіть довге волосся, щоб не забруднити досліджуваний зразок. Виберіть робоче місце під витяжкою або в іншому добре провітрюваному місці і продезінфікуйте його. Перш ніж приступити до роботи, перевірте, чи справні пальник Бунзена і оптичний мікроскоп.
  2. Продезінфікуйте предметне скло.якщо предметне скло недостатньо чисте, вимийте його водою з милом, щоб видалити жир і бруд. Після цього продезінфікуйте його етанолом, очищувачем для скла або іншим способом, який прийнятий у вашій лабораторії.
  3. Помістіть зразок на предметне скло.фарбування за Грамом дозволяє побачити окремі бактерії в медичних зразках або культури бактерій в чашці Петрі. Для початку нанесіть на предметне скло тонкий шар досліджуваної рідини. Рекомендується не витримувати зразок довше 24 годин, так як з часом у бактерій пошкоджуються клітинні стінки, і їх реакція на фарбування за Грамом стає менш передбачуваною.[3]
    • Якщо ви досліджуєте зразок тканин, нанесіть на предметне скло 1-2 краплі. Розподіліть рідину тонким шаром по предметному склу за допомогою краю іншого чистого скла. Зачекайте, поки зразок висохне.
    • Якщо ви фарбуєте бактерії з чашки Петрі, стерилізуйте бактеріологічну петлю в полум'я пальника Бунзена, поки вона не почне світитися, а потім дайте їй охолонути. Нанесіть петлею краплю стерилізованої води на скло, потім повторно стерилізують петлю, дайте їй охолонути, акуратно захопіть крихітний зразок культури бактерій і розчиніть його у воді.[4]
    • Бактерії в живильному середовищі спочатку слід перемішати в вихровому змішувачі, а потім петлею перенести зразок на предметне скло без додавання води.[5]
    • Якщо ви досліджуєте мазок, злегка притисніть його до предметного скла.[6]
  4. Зафіксуйте зразок.під дією тепла бактерії пристануть до скла, і їх не змиє при фарбуванні. Швидко проведіть 2-3 рази предметним склом над верхньою частиною полум'я пальника або нагрійте його на електричному нагрівачі. Не перегрійте предметне скло, щоб не внести зміни в зразок. Якщо ви використовуєте пальник Бунзена, стежте, щоб полум'я було невеликим і мало вигляд блакитного конуса, а не високого оранжевого стовпа.[7]
    • Можна зафіксувати препарат і метанолом. Нанесіть на висушений зразок 1-2 краплі метилового спирту, злийте надлишки спирту і висушіть предметне скло на повітрі. Даний спосіб краще в силу того, що він менше пошкоджує досліджувані клітини і дає більш чистий фон.
  5. Помістіть предметне скло в лоток для фарбування.цей лоток являє собою неглибоке металеве, скляне або пластикове блюдце з дрібною сіткою для підтримки зразків. Покладіть скло з препаратом на сітку, так щоб використовувана при фарбуванні рідина стікала в лоток.
    • Якщо у вас немає лотка для фарбування, предметне скло можна покласти поверх пластикової форми для льоду.[8]

Частина2З 3:
Проведення фарбування по Граму

  1. Нанесіть на зразок розчин кристалічного фіолетового (кристалвіолету).наберіть розчин кристалічного фіолетового (його іноді називають генціановим фіолетовим) в піпетку і нанесіть кілька крапель на препарат. Зачекайте 30-60 секунд. Кристалічний фіолетовий (КФ) дисоціює у воді з утворенням іонів КФ+ і хлору (Cl–). Ці іони проникають через клітинну оболонку і мембрану як грампозитивних, так і грамнегативних клітин. Іони КФ + взаємодіють з негативно зарядженими компонентами бактеріальних клітин і забарвлюють їх у фіолетовий колір.
    • У багатьох лабораторіях використовують "кристалвіолет Хукера". У цю модифікацію входить щавлевокислий амоній, який запобігає випаданню осаду.[9]
  2. Акуратно змийте барвник водою.Нахиліть предметне скло і пустіть на нього слабкий струмінь дистильованої або водопровідної води з промивної склянки. Направляйте струмінь в сторону від препарату, щоб вода лише злегка омивала його.[10] Будьте обережні, так як занадто сильний натиск може змити грампозитивні бактерії.
  3. Нанесіть на зразок йод, потім змийте його.за допомогою піпетки покрийте зразок йодом. Залиште йод хоча б на 60 секунд, після чого акуратно змийте його водою так само, як раніше змили барвник.[11] Йод у вигляді негативно заряджених іонів взаємодіє з іонами КФ+, в результаті чого в зовнішніх і внутрішніх шарах клітин формуються великі комплекси кристалвіолету і йоду. Це фіксує потрапив в клітини кристалвіолет.
    • Йод є їдкою речовиною. Уникайте контакту йоду зі шкірою, не ковтайте його і не вдихайте його пари.
  4. Додайте знебарвлюючу речовину і відразу ж змийте його.зазвичай використовують суміш ацетону і етанолу в пропорції 1:1, при цьому слід акуратно витримати час. Розташуйте предметне скло під кутом і додавайте на нього знебарвлюючий засіб до тих пір, поки стікає рідина не втратить фіолетовий відтінок і стане прозорою. Зазвичай це займає не більше 10 секунд, особливо якщо знебарвлюючий розчин містить велику кількість ацетону. Якщо ви вчасно не зупинитеся, розчин може вимити барвник як з грампозитивних, так і грамнегативних клітин, і вам доведеться повторити процедуру фарбування. Негайно змийте залишки знебарвлюючого розчину так само, як робили це раніше з барвником.
    • В якості знебарвлюючої речовини можна також використовувати чистий (95% і вище) ацетон.[12] чим більше в знебарвлюючому розчині ацетону, тим швидше відбудеться знебарвлення, що зажадає більшої точності.
    • Якщо вам складно вгадати з часом, додавайте знебарвлюючий розчин по одній краплі.[13]
  5. Нанесіть на зразок контрастний барвник і змийте його водою.контрастний барвник, в якості якого використовують зазвичай сафранін або фуксин, дозволяє отримати додатковий контраст між грампозитивними і грамнегативними клітинами за рахунок того, що забарвлює безбарвні (грамнегативні) бактерії в рожевий або червоний колір.[14][15] залиште контрастний барвник на зразку хоча б на 45 секунд, після чого змийте його водою.[16]
    • Фуксин надає багатьом грамнегативним бактеріям (наприклад, таким якhaemophilus і legionella) більш інтенсивний колір.[17] зважаючи на це його рекомендується використовувати новачкам.
  6. Висушіть предметне скло.можна просто залишити його на повітрі, або промокнути фільтрувальним папером.[18] після цього фарбування по Граму завершено.

Частина3З 3:
Перевірка результатів

  1. Підготуйте оптичний мікроскоп.покладіть скло зі зразком на предметний столик. Бактерії значно відрізняються за розмірами, тому вам може знадобитися збільшення від 400x до 1000x.[19] при тисячократному збільшенні для кращого контрасту рекомендується використовувати об'єктив з масляною імерсією. Нанесіть на предметне скло краплю імерсійного масла, і при цьому намагайтеся, щоб скло не рухалося, інакше в маслі можуть утворитися бульбашки.[20] потім за допомогою турелі мікроскопа виставте необхідний Вам об'єктив так, щоб він торкнувся масла.
    • Метод Масляної імерсії застосуємо лише для спеціальних, а не "сухих" об'єктивів.
  2. Визначте грампозитивні та грамнегативні бактерії. Розгляньте предметне скло під оптичним мікроскопом. Грампозитивні бактерії будуть пофарбовані у фіолетовий колір, оскільки всередині їх товстих клітинних стінок виявився кристалвіолет. Грамнегативні бактерії повинні бути рожевими або червоними, так як кристалвіолет був вимитий через їх тонкі клітинні стінки, після чого в них проник рожевий контрастний барвник.
    • Якщо зразок занадто товстий, це може призвести до помилкових позитивних результатів. Якщо бактерії всіх типів виглядають як грампозитивні, пофарбуйте ще один зразок, щоб упевнитися в правильності результатів.
    • Якщо зразок занадто довго перебував під впливом знебарвлюючого розчину, це може привести до помилкових негативних результатів. Пофарбуйте ще один зразок, щоб переконатися в тому, що всі бактерії дійсно грамнегативні.
  3. Порівняйте свої результати з еталонними зображеннями.якщо ви не впевнені в тому, які бактерії бачите, то перегляньте набір еталонних зображень, які відсортовані за формою бактерій і результатами фарбування за Грамом. Подібний набір можна знайти в Інтернеті на National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos і багатьох інших сайтах. Нижче наведені найбільш поширені або важливі для діагностики приклади, які допоможуть вам ідентифікувати бактерії.
  4. Розпізнайте грампозитивні бактерії за формою.Вид бактерій можна визначити за їх формою в мікроскопі: часто це бувають коки (округлі) і бацили (паличкоподібні). Ось кілька поширених форм грампозитивних (фіолетових) бактерій:
    • Грампозитивні коки — як правило це стафілококи (у вигляді виноградних грон) або стрептококи (утворюють ланцюжки).
    • Грампозитивні палички включають в себе бацили, клостридії, коринебактерииі лістерії. Представники родуактиноміцети часто мають відгалуження і нитки.[21]
  5. Розпізнайте грамнегативні бактерії.часто грамнегативні (рожеві) бактерії поділяють на три групи: коки (округлі), паличкоподібні (довгі і тонкі) і кокковідние, які мають проміжну форму.
    • Грамнегативні коки найчастіше представлені різними видамиNeisseria .
    • Грамнегативні палички включають в себекишкову паличку ,ентеробактерії ,клебсієли ,цитробактерії ,серратії ,протеї ,сальмонели ,шигели ,псевдомонади і багато інших. холерні вібріони також можуть мати вигляд звичайних або вигнутих паличок.[22]
    • Грамнегативні" кокковидні "палички (або"коккобацили") включають в себе бордетелли, бруцели, гемофіли і пастерели.
  6. Оцініть неоднозначні результати.деякі бактерії не піддаються однозначному фарбуванню через те, що їх клітинні стінки неміцні або покриті жирами. Такі бактерії можуть одночасно фарбуватися в фіолетовий і рожевий колір в межах однієї клітини, або клітини одного і того ж виду можуть фарбуватися по-різному в одному мазку. Подібна проблема може спостерігатися на будь-якому зразку бактерій, який пролежав більше 24 годин, проте деякі види бактерій схильні до цього незалежно від свіжості зразка. У цьому випадку для точного визначення бактерій можуть знадобитися більш спеціалізовані методи, такі як забарвлення по цілю-Нільсену, спостереження за ростом культури, тест TSI (потрійний цукор заліза), генетичне тестування.[23]
    • актиноміцети,артробактерії ,коринебактерии ,мікобактерії іпропіонбактерії вважаються грампозитивними, проте часто їх фарбування за Грамом призводить до неоднозначних результатів.[24]
    • Дрібні і тонкі бактерії, такі яктрепонеми ,хламідії ірикетсії , погано піддаються фарбуванню по Граму.[25]
  7. Викиньте використані матеріали.процедура утилізації відходів залежить від конкретної лабораторії і того, які матеріали використовувалися. Як правило, рідина з лотка для фарбування вважається небезпечним матеріалом і переливається в щільно закриваються пляшки. Використані Предметні скла вимочуються в 10%-ному розчині відбілювача, після чого поміщаються в контейнери для збору та утилізації голок і медичних відходів.

Поради

  • Пам'ятайте про те, що результати фарбування по Граму багато в чому визначаються тим, наскільки хороший зразок. Необхідно навчити пацієнтів отримувати хороші зразки для аналізу (наприклад, мокроту після глибокого кашлю, а не просту слину).
  • При знебарвленні етиловий спирт діє повільніше, ніж ацетон.
  • При роботі в лабораторії дотримуйтесь стандартну техніку безпеки.
  • Для практики використовуйте ватяну паличку, оскільки зразок повинен містити як грампозитивні, так і грамнегативні бактерії. Якщо спостерігається лише один тип бактерій, то це, швидше за все, означає, що ви або недостатньо, або занадто сильно обробили зразок знебарвлюючим розчином.[26]
  • Предметні скла можна брати дерев'яною прищіпкою.[27]

Попередження

  • Ацетон і спирт вогненебезпечні. При попаданні на долоні ацетон знежирює шкіру, в результаті чого в неї легше вбираються інші речовини. Одягайте рукавички і дотримуйтесь інших запобіжних заходів.
  • Слідкуйте за тим, щоб препарат не висох, перш ніж ви змиєте основний або контрастний барвник.[28]

Що вам знадобиться

  • зразок тканини
  • скляні Предметні скла
  • піпетка
  • джерело полум'я, нагрівач предметних стекол або метанол
  • Вода
  • кристалічний фіолетовий
  • Йод
  • знебарвлююча рідина, наприклад спирт або ацетон

Джерела

  1. Isenberg, H.D. (ed). 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook . American Society for Microbiology, Washington, D.C.
  2. Isenberg, H.D. (ed). 1995. Essential Procedures for clinical Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
  3. ↑ Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams &#amp; Wilkins.
  4. ↑ Gram, HC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 185–9.
  5. ↑ Http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
  6. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  7. ↑ Http://www.austincc.edu/microbugz/gram_stain.php
  8. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  9. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  1. ↑ Http://www.buffalo.edu/content/dam/www/facilities/ehs/policies/lab-safety-policies/Gram%20Staining%20Waste%20Procedure.pdf
  2. ↑ Http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
  3. ↑ Http://iws.collin.edu/mweis/Microbiology/Lab/Lab%20Discussions_Handouts/Gram%20Stain%20Steps.pdf
  4. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  5. ↑ Http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
  6. ↑ Http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
  7. ↑ Beveridge TJ, Davies JA (November 1983). "Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain". Journal of bacteriology 156 (2): 846–58.
  8. ↑ Davies JA, Anderson GK, Beveridge TJ, Clark HC (November 1983). "Chemical mechanism of the Gram stain and synthesis of a new electron-opaque marker for electron microscopy which replaces the iodine mordant of the stain". Journal of bacteriology 156 (2): 837–45.
  9. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  10. ↑ Http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram1.htm
  11. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  12. ↑ Http://www.microscope.com/education-center/how-to-guides/grams-stain/
  13. ↑ Http://www.cargille.com/immersionoilmicroscope.shtml
  14. ↑ Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8385/
  15. ↑ Http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&#amp;brch=73&#amp;sim=208&#amp;cnt=2
  16. ↑ Http://archive.crohn.ie/primer/bactid.htm
  17. ↑ Http://www.microrao.com/micronotes/pg/Gram%20stain.pdf
  18. ↑ Http://www.microrao.com/micronotes/pg/Gram%20stain.pdf
  19. ↑ Http://www.microscope.com/education-center/how-to-guides/grams-stain/
  20. ↑Http://www.flinnsci.com/teacher-resources/biology/frequently-asked-biology-questions/culture-media-and-stains-preparation-and-use-tips/how-do-i-perform-a-gram-stain/
  21. ↑ Http://www.flinnsci.com/teacher-resources/biology/frequently-asked-biology-questions/culture-media-and-stains-preparation-and-use-tips/how-do-i-perform-a-gram-stain/

Ще почитати: